荧光定量标准曲线知道斜率如何算扩增效率

1做标曲才可以算出这对引物的扩增效率（其斜率）,方便用pfaffl方法来进行相对定量（得到的结果相对精确一点）,否则只能默认扩增效率为2,用2^-ddCt(Livak)法来计算2做标曲才可以绝对定量.

这个一般是用SYBYGreen作为荧光染料的时候需要做的工作!因为SYBYGreen染料是非特异的染料,只要有扩增,染料就可以镶嵌在双链中发出荧光.我们做溶解曲线是为了观察我们扩增发出荧光的片段是不是

首先你这样做出来的统计没有意义.应该是至少3次独立实验,而不是重复3次PCR.如果3次试验,每次重复3次（取平均值算一次）.然后先定各个基因在对照组的值为一,再算出其他组该基因的相对量,比如内参CT值

设计精密,操作规范

打开软件-setup-advacedsetup-左手setup中第一行experimentproperties中有一项是whichreagentsdoyouwanttousetodetecttheta

如果你测定的基因序列未知,可以用同源基因或者别的物种的同类基因序列来设计引物,进行PCR,看看是否能够扩增出产物,并对产物进行确认,判断扩增的特异性.如果确认无误,就可以进行荧光定量PCR.再问：我想

先看meltcurve,斜率不对可能反应特异性不好,检查是否有非特异产物.如果是特异性问题,调整反应条件或检查引物设计.标准曲线看斜率之前,先要看线性（几个标准点是否在一条直线上）,关键指标是决定系数

可以直接用DNA模板,只要DNA模板质量够好.

看标准曲线是否反映出了标准物质的真实浓度再问：那请问标准曲线中的R2代表什么意思？为什么说R2>0.99可信度就高？再答：R2决定系数，英文（coefficientofdetermination），有

是的啊!但是你要在一起上标注好哪个是标样以及重复,他就自动生成了再问：谢谢请问具体怎样设置最后才会自动出现标准曲线啊？？？再答：每个机器不一样我用的是biorad的，然后P上之前有一个面板显示96孔，

扩增效率理论上不可能超过2.计算值超过2,可能是因为PCR效率不高或者不稳定,结果线性度差,导致某个区间的数据点计算出来的扩增效率反而大于2.这样的标准曲线如果作图的话,数据点都不在一条直线上.一般都

ROX加多了,终浓度太高?或者模板量,PCR扩增效率低下?

分几次的话那就得每次都做标准曲线了!只需要做一条就可以了其实一般做都是半定量的也就是测几个之间的相对含量根本不需要做标准曲线再问：我有样本、内参在同一平板做PCR，标准品准备一份还是2份呢？标准品里要

啥叫不同阶段只要模板不同就要检测内参标准曲线是指拿已知浓度的标准品做出来的曲线不是一个概念

对这个是必须的.再问：那每次做的标准曲线的差异怎么去评价呢？差异在什么范围内可以呢？谢谢再答：必须的每次都做做标准！

不需要完全符合等差数列的.你说说看相关系数R2和扩增效率E的结果怎么样,之后再考虑调整体系和qPCR程序.

溶解曲线是在正常的PCR反应基础上加一个溶解曲线的反应条件,其中当温度由60℃升至95℃时,PCR仪每隔一定的温度检测一次信号.最后将收集的信号绘制出溶解曲线,然后将溶解曲线一次微分就会得到我们平时看

你要重新设计引物了有引物2具体有好几个峰,谁也不知道是哪个,是产物的话主要看溶解温度,溶解温度高一般是产物.建议重新设计引物,重做梯度PRC电泳分析.再问：懒得做电泳了，引物是没有问题的，因为是参考文

扩增效率E和R的平方

1、调整下体系,不要自己配置反应液,最好用商品的MIX,这样各个组分都是最佳的配比.2、三步法改为两步法,退火延伸设置为一步,大部分的温度为60度,这个只是建议,具体看你买的试剂的说明书,会有具体的说